RNA m6A修饰问题汇总(第一期)

 新闻资讯     |      2022-08-09 20:36:50    |      小编

        RNA m6A修饰无疑是表观转录组学中最受关注的研究内容之一,目前的研究已经表明,m6A可能影响mRNA的运输、降解、翻译以及代谢等方方面面,这种转录后修饰参与多种病理生理过程。mRNA m6A研究该注意哪些问题?高通量测序获得的差异甲基化分子该如何挑选?下游分子实验该如何设计?纽科生物长期关注并参与RNA m6A修饰的课题,我们精心筛选并整理了有关m6A研究的常见问题,结合近期发表的m6A文献综述,给各位老师提供全面答疑。

参考文章封面:

 

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文章原文:m6A RNA methylation: from mechanisms to therapeutic potential

 

mRNA m6A修饰的位点序列、分布特征:

1)什么样的序列会发生m6A修饰(序列偏好性)?m6A甲基化修饰主要受METTL3/METTL14酶调控,修饰特征序列为DRACHD:A\G\UR=A\GH=A\C\U),但是注意,并不是所有符合该序列规则的序列都能被甲基化,仅有小部分含有DRACH motif序列的片段能发生m6A修饰。目前文章中通常使用motif分析(图1)进行序列富集的结果展示。

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1m6A MotifYTHDF3 facilitates translation and decay of N6-methyladenosine-modified RNA

2)m6A修饰通常发生在什么区域,UTR还是CDS区(区域偏好性)?研究显示m6A目前主要发生在终止密码子附近和基因内部较长的外显子中(图2),根据数据表明,基因内部外显子中长度超过200nt的个数占所有内部外显子个数的15%,但是这些外显子中有近80%m6A修饰位点,出现这个现象的原因并不是因为这些较长的内部外显子存在大量的motif,事实上这些外显子只含有30%左右的motif序列。临近可变多聚腺苷酸化(APAm6A事件要多于远端APA位点。 METTL3/METTL14调控的m6A修饰系统并不仅仅受限于DRACH序列,还有更复杂的调控机制共同决定m6A修饰的发生位置。

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2m6A区域偏好性(m6A RNA methylation: from mechanisms to therapeutic potential

3)什么因素决定m6A的位置选择(调控过程)?内部、外部因素共同决定调控m6A修饰位点选择与过程,m6A调控蛋白(Writer, EraserReader)和靶基因作为一个系统,内部和外部是针对该系统进行定义,实际上m6A如何发生以及怎样发生通常是受很多因素共同调控的,内部因素包括特定序列与METTL3/METTl14的结合偏好性,外部因素主要依赖于转录因子,RNA结合蛋白(例如TARBP2),RNA聚合酶,H3K36me3组蛋白修饰可以募集METTL3/METTL14mRNA并催化发生m6A修饰,当然FTOALKBH5也能在METTL3/METTL14之后在对m6A修饰水平进行改变。但是在这样一个复杂的系统中,多种因素如何共同决定m6A位点选择的疑问仍然没有被完全解答。

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3m6A修饰的调控系统(m6A RNA methylation: from mechanisms to therapeutic potential

4)既然有内外部因素共同决定,哪个占主导?如果外部因素占主导,那么理论上m6A修饰会成为一个高度动态的过程,细胞状态改变,多种外部调控因素也会改变,m6A水平理应对不同状态下包括RBP在内的这些外部因素会有动态应答;如果内部因素占主导,那么甲基化酶的改变会影响整体m6A的修饰,但不同位点m6A水平变化是相对有限的;也有可能内、外部调控机制交织在一起,共同调控m6A修饰的位置、区域和水平,该问题还需要进一步研究。

5)除了m6A本身变化以外,有其他重要因素影响m6A调控吗?有,那就是RNA m6A阅读蛋白,也就是通常说的Reader蛋白,Reader蛋白也会竞争性的结合m6A位点,且Reader蛋白本身的结合水平和表达水平都会对m6A修饰基因产生影响,这就是为什么有时我们看到当m6A水平并没有发生改变时,不同比例、水平的Reader蛋白也会造成被修饰基因发生改变的主要原因,当然发生在Reader蛋白上的翻译后修饰也能对Reader蛋白自身的酶活、细胞定位以及结合亲和性产生影响,所有这些综合起来共同对mRNA m6A进行调控(图4)。

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4YTH家族蛋白参与mRNA的代谢、翻译和降解

Main N6-Methyladenosine Readers: YTH Family Proteins in Cancers

6)m6A修饰的特异性的作用:这种修饰特异性带来的最直接影响是m6A介导的基因选择性表达,一旦m6A集中在特定部分转录本群体时,m6A 阅读蛋白的调控系统就会发挥重要功能。在研究示例中,小鼠胚胎干细胞mESCs80%能调控多能性的基因都受到m6A修饰,这种修饰促进这些转录本的清除,从而让细胞状态由多能性转向胚胎干细胞分化。不同位置的m6A修饰也有可能影响表达,m6A介导的调控效果依据位置的不同而不同。

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5Mettl3 KO ESCs resist termination of naïve pluripotency

m6A mRNA methylation facilitates resolution of naïve pluripotency toward differentiation

7)m6A mRNA的作用是什么?m6A修饰影响mRNA的降解和翻译是目前主要观点。YTHDF家族蛋白(包括YTHDF1YTHDFYTHDF)在内的m6A阅读蛋白调控m6A靶分子降解和翻译。最早研究的YTHDF2可以通过多种途径造成m6A mRNA发生降解,比如募集CCR4-NOT复合物或者RNase P/MRP复合物至m6A mRNA使其发生降解;YTHDF1YTHDF3调控靶mRNA的翻译,YTHDF1募集eIF3蛋白,YTHDF3协同YTHDF1共同影响靶mRNA的翻译,当然IGF2BP1IGFBP2IGFBP3也会结合m6A修饰转录本并增强其稳定性(图4)。

 

8)如果进行高通量测序之后,靶点的挑选和下游实验该如何进行?通过上述解答不难看出,对于m6A修饰通常是基因、位点、区域、功能特异的,因此如果在进行高通量测序之后选择靶点时,首先应当考虑靶分子的功能,该分子应当同所研究的疾病和生物学过程具有紧密的联系(如在肝癌中选择SOCS2),其次应当考虑该位点相关测序参数,如甲基化倍数改变(fold change)和该分子的表达倍数改变,从上述问题可以明确看到不同的调控机制给靶基因带来不同的影响,因此要重点关注转录本甲基化水平改变的同时也要关注表达改变,此外还可以结合现有数据库进行分析,从上述问题中可以发现部分RBP和转录因子本身对m6A修饰也会产生影响,参考其他RBP相关数据库(POSTARRMBase等)可以综合考虑是否在下游实验设计当中嵌入其他分子(尤其是Reader蛋白),综合以上信息进行挑选靶点对下游的研究故事完整性有很大帮助。

 

RNA m6A修饰仍然是当下最火的科研热点之一,有关RNA m6A的相关研究还在继续,我们将在接下来的推送中为大家解决更多具有代表性的科研问题,请各位老师持续关注。

 

 

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